助力生物藥研發(fā)，淺談ADC藥物DAR值測(cè)定
發(fā)布時(shí)間:2021-10-28 閱讀次數(shù)：1717次
導(dǎo)語(yǔ)
從上世紀(jì)初德國(guó)醫(yī)學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)得主Paul Ehrlich（保羅埃爾利希）提出ADC（Antibody-Drug Conjugate，抗體藥物偶聯(lián)物）的概念至今，ADC藥物已經(jīng)發(fā)展至第三代，一系列特異性偶聯(lián)技術(shù)使得生產(chǎn)工藝變得更加穩(wěn)定，能夠得到穩(wěn)定藥抗比的藥物，對(duì)于ADC藥物的療效和安全性都有很大的貢獻(xiàn)，推動(dòng)了ADC藥物的研發(fā)?？贵w藥物偶聯(lián)物ADC是具有靶向作用的單克隆抗體與具有特定藥理學(xué)特性（如細(xì)胞毒作用）的化合物的結(jié)合，兩部分通過(guò)連接子偶聯(lián)為一個(gè)整體。DAR（Drug-to-Antibody Ratio，藥物抗體比值）是抗體藥物偶聯(lián)物的一個(gè)關(guān)鍵屬性，是ADC藥物研發(fā)過(guò)程重要的質(zhì)控環(huán)節(jié)。
ADC藥物
帶您了解DAR值如何檢測(cè)
ADC藥物從本質(zhì)上講是混合物，是由連接不同個(gè)數(shù)小分子藥物的單抗組成，DAR代表的是每個(gè)單抗上連接小分子藥物的平均數(shù)量，DAR直接影響ADC藥物的療效和安全性，藥物研發(fā)階段應(yīng)盡量縮小DAR值的變動(dòng)區(qū)間。
ADC藥物的偶聯(lián)位點(diǎn)分為單抗賴氨酸殘基上的氨基和半胱氨酸殘基上的巰基。通過(guò)賴氨酸偶聯(lián)的DAR往往比較小，而潛在的偶聯(lián)位點(diǎn)卻很多，偶聯(lián)反應(yīng)具有隨機(jī)性，產(chǎn)物異質(zhì)性較大；ADC藥物研發(fā)使用的單抗有4對(duì)鏈間二硫鍵，抗體通過(guò)部分還原使鏈間二硫鍵轉(zhuǎn)換成游離的半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基中的巰基與連接子中的馬來(lái)酰亞胺基反應(yīng)形成ADC，一般連接的小分子數(shù)量為0、2、4、6和8，如圖所示。
半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物DAR分布
DAR測(cè)定的方法有多種，可分為光譜法、色譜法和質(zhì)譜法，可根據(jù)ADC的特性及偶聯(lián)工藝等因素選擇合適的方法，具體如下：
紫外/可見光譜法(UV/Vis）
紫外/可見光譜法是檢測(cè)DAR值最簡(jiǎn)單穩(wěn)定的方法，這種方法需要抗體和小分子藥物具有不同的最大吸收波長(zhǎng)，分別計(jì)算二者的濃度進(jìn)而得到ADC的DAR值，適用于多種ADC。
色譜法
色譜法包括疏水作用色譜（HIC）和反相高效液相色譜法(RP-HPLC)兩種，適用于測(cè)定半胱氨酸偶聯(lián)的ADC。疏水作用色譜法能將不同DAR值的組分根據(jù)疏水性的差異分離開，且保持ADC分子的結(jié)構(gòu)完整性；反相高效液相色譜法需要先將抗體還原得到輕、重鏈再進(jìn)行分析，可用于補(bǔ)充驗(yàn)證疏水作用色譜法的結(jié)果，并且適用于質(zhì)譜分析。
質(zhì)譜法
質(zhì)譜法適用于賴氨酸偶聯(lián)的ADC的DAR值測(cè)定，包括液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和MALDI-TOF-MS。賴氨酸偶聯(lián)的ADC具有較強(qiáng)的異質(zhì)性，增加了質(zhì)譜譜圖解析的難度，通常在測(cè)定前需對(duì)ADC進(jìn)行額外的前處理，如去糖基化和去除C端賴氨酸異質(zhì)性。
我們能做什么？
疏水作用色譜法解決方案
我們使用生物兼容液相系統(tǒng)（Nexera Bio）建立了一種疏水作用色譜方法用于抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）中藥物抗體比值（DAR）和藥物分布的測(cè)定。
生物兼容液相系統(tǒng)（Nexera Bio）
Nexera Bio系統(tǒng)通過(guò)對(duì)關(guān)鍵部位的惰性化升級(jí)，在耐受高壓的前提下，升級(jí)的惰性表面降低了生物大分子在管路進(jìn)樣針、檢測(cè)器中的吸附，并且可耐受高鹽洗脫體系，更適合于生物大分子樣品的分析。通過(guò)梯度洗脫，降低鹽濃度，增加有機(jī)相比例，可將偶聯(lián)不同藥物數(shù)量的ADC分離，未偶聯(lián)藥物的抗體疏水性最弱，最先被洗脫，連接8個(gè)藥物的抗體疏水性最強(qiáng)，最后被洗脫。峰面積百分比代表特定藥物數(shù)量連接的ADC的相對(duì)分布。通過(guò)峰面積百分比和偶聯(lián)藥物數(shù)量計(jì)算加權(quán)平均DAR。
我們將此方法應(yīng)用于實(shí)際藥物的分析，并進(jìn)行了重復(fù)性考察，發(fā)現(xiàn)液相系統(tǒng)穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。
實(shí)際樣品色譜圖
表2. 6次進(jìn)樣數(shù)據(jù)重復(fù)性結(jié)果
我們還能做什么？
島津的產(chǎn)品線比較全面，包括紫外-可見吸收光譜、高效液相色譜、LCMS-Q-TOF以及MALDI-TOF質(zhì)譜，可滿足不同用戶對(duì)于儀器的需求，較全面覆蓋ADC藥物DAR值測(cè)定以及其它生物制品的研發(fā)質(zhì)控。
結(jié)語(yǔ)
經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展，ADC藥物研究取得了巨大進(jìn)展，已上市藥物數(shù)量達(dá)到了12個(gè)，在研管道300多種。無(wú)論是賴氨酸偶聯(lián)還是半胱氨酸偶聯(lián)的ADC藥物，都是復(fù)雜的混合藥物，應(yīng)該通過(guò)工藝的改進(jìn)更好地控制DAR值變動(dòng)區(qū)間，降低ADC藥物的異質(zhì)性。島津一直關(guān)注生物藥行業(yè)的發(fā)展，希望以我們的儀器平臺(tái)為產(chǎn)品研發(fā)助力，推動(dòng)新藥安全、有效地走向臨床，造福社會(huì)。