前沿合作 | 基于島津MALDI-TOF技術(shù)平臺檢測7種人冠狀病毒及新型冠狀病毒分型與重要突變位點(diǎn)的方法研究
發(fā)布時間:2022-01-10 閱讀次數(shù)：724次
SARS-CoV-2變異株的出現(xiàn)，使全球面臨第二波冠狀病毒疾病大流行的危機(jī)
目前，已知可以感染人的冠狀病毒共有7種，分別為20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒HCoV-229E和HCoV-OC43，2003年新出現(xiàn)的SARS冠狀病毒SARS-CoV，2004年發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒HCoV-NL63，2005年新發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒HCoV-HKU1，2012年7月在中東地區(qū)出現(xiàn)的MERS冠狀病毒MERS-CoV以及2019年12月下旬爆發(fā)的嚴(yán)重性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。其中，2019冠狀病毒病（Coronavirus disease 2019，COVID-19）引起了全球持續(xù)地大流行。盡管全球采取了許多干預(yù)和控制措施，截至2022年1月4日，已有200多個國家受到該病毒的影響，實(shí)驗(yàn)室確診的COVID-19病例人數(shù)已超過2.9億，死亡人數(shù)超過540萬。
本次研究基于島津AXIMA Performance MALDI-TOF質(zhì)譜檢測平臺，旨在提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的用于檢測7種人冠狀病毒（人冠狀病毒229E、NL63、HKU1、OC43、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2），及新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）分子分型與重要變異株的檢測方法。
島津應(yīng)對策略及解決方案
通過合理選擇設(shè)計(jì)位點(diǎn)、適當(dāng)添加修飾堿基，可以將延伸探針的質(zhì)量加以區(qū)分，均勻分布于檢測范圍之內(nèi)，從而達(dá)到多重檢測的目的。整個檢測反應(yīng)流程分為五步（圖1）：
圖1 島津AXIMA Performance MALDI-TOF用于7種人冠狀病毒及新型冠狀病毒分型與重要突變位點(diǎn)的檢測流程示意圖
第一步是一步法多重PCR反應(yīng)，根據(jù)待檢測位點(diǎn)兩端的側(cè)翼序列來設(shè)計(jì)引物與探針，在一個反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄PCR與多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從而達(dá)到擴(kuò)增待測位點(diǎn)的目的。第二步應(yīng)用蝦堿性磷酸酶（Shrimp alkaline phosphatase，SAP）對上一步PCR的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行處理，消化掉剩余的脫氧核酸核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）。第三步是單堿基延伸反應(yīng)。事先針對每個檢測位點(diǎn)設(shè)計(jì)一條短探針，探針可以結(jié)合到第一步PCR的擴(kuò)增子上，同時令探針結(jié)合之后，延伸的第一個堿基就是要檢測的多態(tài)性位點(diǎn)。向第二步的產(chǎn)物中加入這些探針，使用經(jīng)修飾的雙脫氧三磷酸核苷（ddNTP）作為反應(yīng)底物，再配合專用的擴(kuò)增酶進(jìn)行反應(yīng)。第四步是樹脂純化。第五步是質(zhì)譜檢測。將第四步的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到包被基質(zhì)的點(diǎn)樣靶板上，待樣本結(jié)晶之后，使用飛行時間質(zhì)譜儀檢測延伸的單堿基質(zhì)量大小，來判定檢測靶基因的有無，從而進(jìn)一步判定樣本中目標(biāo)病原體的有無。
本方法經(jīng)特異度評估、靈敏度評估以及穩(wěn)定性評估，結(jié)果如下：
l 使用28種常見呼吸道病原進(jìn)行本方法特異度檢測，測試結(jié)果顯示，該方法與常見呼吸道病原均無交叉反應(yīng)，說明該方法具有良好的特異度；
l 梯度稀釋核酸樣本，測試本方法的靈敏度，測試結(jié)果顯示本方法檢出限為250copies/mL；
l 使用多個樣本檢測本方法的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果顯示，不同檢測樣本的檢測結(jié)果一致，該方法表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。
方法 · 特點(diǎn)
創(chuàng)新性地使用一步法多重PCR技術(shù)與核酸質(zhì)譜檢測分析方法聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)從臨床樣本核酸提取后直接進(jìn)行檢測和分型，不需要額外進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄，很大程度上縮短檢測時間和減小試劑的消耗；
與高通量測序技術(shù)相比，該方法一次性可處理和分析96或384份樣本，且可在一天內(nèi)獲得7種人冠狀病毒的檢測結(jié)果，及SARS-CoV-2基因組中重要的突變信息，并對其進(jìn)行分型，特別適用于大規(guī)模的流行病學(xué)研究和重要型別的監(jiān)測；
該方法具有靈活易用的特點(diǎn)，隨著SARS-CoV-2病毒的不斷地進(jìn)化和基因組新突變的產(chǎn)生，新出現(xiàn)的重要突變位點(diǎn)可以被納入用來設(shè)計(jì)更全面的檢測方法。
結(jié)論
島津中國創(chuàng)新中心與中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所合作開發(fā)了一種基于MALDI—TOF平臺檢測7種人冠狀病毒及新型冠狀病毒分型與重要突變位點(diǎn)的檢測方法。利用一步法多重PCR與MOLDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用來鑒定7種人冠狀病毒與新型冠狀病毒的重要突變位點(diǎn)。我們通過對包含新型冠狀病毒在內(nèi)的7種人冠狀病毒的每一種目標(biāo)病原體，選擇種間特異且種內(nèi)保守的基因作為檢測靶基因，同時根據(jù)GISAID公布的用于新型冠狀病毒分型與重要突變位點(diǎn)檢測的重要突變位點(diǎn)作為靶點(diǎn)。針對上述檢測靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)檢測試劑，旨在開發(fā)和評估一種可直接用于7種人冠狀病毒檢測和新型冠狀病毒分型的快速、簡便、無須測序的方法。該方法的建立為動態(tài)監(jiān)測SARS-CoV-2病毒的感染和主要型別的全球流行情況提供強(qiáng)有力的手段。
*文中推薦技術(shù)方法方案僅用于醫(yī)學(xué)及科研人員技術(shù)交流，不作為臨床診斷依據(jù)。
*本研究的相關(guān)成果已申請國家專利（申請?zhí)枺?02111084113.0）。