抗生素也能測(cè)序？當(dāng)多肽類(lèi)抗生素遇見(jiàn)蛋白質(zhì)測(cè)序儀
發(fā)布時(shí)間:2022-12-26 閱讀次數(shù)：623次
導(dǎo)讀
抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用挽救了無(wú)數(shù)人的生命，被稱(chēng)為“20世紀(jì)最偉大的醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)”。然而，臨床抗生素的濫用，使多重耐藥菌成為抗感染治療的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。人體毒性低、抗多重耐藥菌的新型抗生素的研制與開(kāi)發(fā)，一直是臨床上的重要課題。在抗生素的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)中，抗生素結(jié)構(gòu)的確認(rèn)至關(guān)重要。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)，抗生素可以分為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、多肽類(lèi)等抗生素，其中多肽類(lèi)抗生素符合多肽的結(jié)構(gòu)特征，可以使用蛋白質(zhì)測(cè)序儀進(jìn)行氨基酸殘基順序的確認(rèn)。常見(jiàn)的多肽類(lèi)抗生素有多粘菌素類(lèi)（多粘菌素B、多粘菌素E）、桿菌肽類(lèi)和萬(wàn)古霉素等，其中多黏菌素和萬(wàn)古霉素被認(rèn)為是對(duì)抗某些多重耐藥菌的最后一道防線。今天，我們以多粘菌素B為例，一起來(lái)看看蛋白質(zhì)測(cè)序儀PPSQ如何測(cè)定多肽類(lèi)抗生素的氨基酸序列。
快速了解多粘菌素B
多黏菌素B( Polymyxin B，PMB）于1947 年在多黏類(lèi)芽孢桿菌( Bacillus polymyxa) 中發(fā)現(xiàn)，是一種五價(jià)陽(yáng)離子型（含5個(gè)α, γ--二氨基丁酸）十肽抗生素，由N-端脂肪?；?、線性三肽、環(huán)狀七肽構(gòu)成，對(duì)革蘭氏陰性桿菌有強(qiáng)效殺菌作用，但由于具有較高的腎毒性，只能局部( 耳、眼) 用藥。PMB為發(fā)酵的混合型多肽類(lèi)抗生素，組分種類(lèi)較多，目前已發(fā)現(xiàn)的組分超過(guò)30種，其中占比較高的四種主要組分包括B1、Ile-B1、B2、B3。這四種組分組成氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、二氨基丁酸，結(jié)構(gòu)通式及信息表見(jiàn)下。
圖1 多黏菌素B的結(jié)構(gòu)通式
表1 多黏菌素B組分信息表
島津解決方案
目前對(duì)多黏菌素B結(jié)構(gòu)的研究主要為氨基酸組成成分、氨基酸構(gòu)型分析等，氨基酸序列的研究報(bào)道較少。氨基酸序列是其能否正確發(fā)揮生物活性的重要基礎(chǔ)，島津與上海藥檢所合作開(kāi)發(fā)了應(yīng)用蛋白質(zhì)測(cè)序儀對(duì)多粘菌素B進(jìn)行氨基酸序列分析的方法[1]。蛋白質(zhì)測(cè)序儀執(zhí)行全自動(dòng)化的Edman降解反應(yīng)，從N端開(kāi)始測(cè)定每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸種類(lèi)。本研究以B2組分為例，對(duì)其進(jìn)行分離純化和酶解后，獲得去除N-?；炬溂?位二氨基丁酸的肽鏈，解除了N端封閉，通過(guò)蛋白質(zhì)測(cè)序儀PPSQ-53A測(cè)定其氨基酸順序。
? 儀器配置及序列分析原理
Edman降解法是進(jìn)行N端氨基酸序列分析的經(jīng)典方法，島津以其為原理設(shè)計(jì)的全自動(dòng)蛋白質(zhì)測(cè)序儀（以下簡(jiǎn)稱(chēng)PPSQ），由液相系統(tǒng)和可執(zhí)行自動(dòng)化Edman降解反應(yīng)的主機(jī)組成，將氨基酸從多肽鏈的N端依次切割下來(lái)，通過(guò)色譜的保留時(shí)間判定氨基酸種類(lèi)，結(jié)果直接可靠。PPSQ除了測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)氨基酸外，還可以測(cè)定非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。多粘菌素B中含有非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸α, γ--二氨基丁酸（DABA），可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間的測(cè)定與其他標(biāo)準(zhǔn)氨基酸一起進(jìn)行氨基酸種類(lèi)的鑒別。
島津蛋白質(zhì)測(cè)序儀PPSQ-53A
Edman降解反應(yīng)圖解
? 樣品前處理
使用液相系統(tǒng)純化制備多黏菌素B2組分（PMB2），加入無(wú)花果蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，解除N端封閉。PMB2酶解后的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)下圖。通過(guò)液相系統(tǒng)對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得去除N-?；炬溂半S后1位二氨基丁酸的肽鏈，使用PPSQ-53A測(cè)試樣品N端前9個(gè)氨基酸的序列。
多黏菌素B2的酶解產(chǎn)物
? 經(jīng)酶解處理的多黏菌素B2氨基酸序列分析色譜圖
應(yīng)用蛋白質(zhì)測(cè)序儀PPSQ-53A分析經(jīng)酶解處理的多黏菌素B2組分的氨基酸序列，色譜圖顯示，樣品氨基酸序列為T(mén)hr-DABA-X-DABA-Phe-Leu-DABA-DABA-Thr（X代表無(wú)信號(hào)檢出），與理論順序一致。第三位氨基酸在原構(gòu)型中與相鄰氨基酸為環(huán)狀連接，當(dāng)Edman反應(yīng)發(fā)生時(shí)，一端被切開(kāi)，另一端仍與相鄰氨基酸相連，因此在檢測(cè)中理論無(wú)氨基酸信號(hào)產(chǎn)生。
PMB2酶解產(chǎn)物的氨基酸序列分析色譜
結(jié)語(yǔ)
蛋白質(zhì)及多肽的N端氨基酸序列分析，一直以來(lái)是生物藥領(lǐng)域蛋白及多肽類(lèi)藥物質(zhì)量控制的經(jīng)典方法，也是未知活性多肽及蛋白質(zhì)鑒定的重要依據(jù)。島津蛋白質(zhì)測(cè)序儀，自1988年第一代產(chǎn)品發(fā)布以來(lái)，持續(xù)三十多年來(lái)服務(wù)于生命科學(xué)研究、生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣大用戶(hù)，本研究中對(duì)多肽類(lèi)抗生素多粘菌素B氨基酸序列的分析，讓我們期待蛋白質(zhì)測(cè)序儀將來(lái)可以為更多新型多肽類(lèi)抗生素及其他活性抗菌肽的開(kāi)發(fā)發(fā)揮價(jià)值。
參考文獻(xiàn)（上海藥檢所和島津聯(lián)合發(fā)表）：
[1] Zhang H , Li F , Dun J , et al. Combination of Derivatization–HPLC–MS and Enzymatic Hydrolysis–Edman Degradation for Amino Acid Sequence and Configuration of Polymyxin B Components[J]. Chromatographia, 2021, 84(11):1057-1064
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