成像質(zhì)譜顯微鏡在中藥研究應(yīng)用專輯-不同生長期藥材研究案例盤點(diǎn)
發(fā)布時間:2025-02-18 閱讀次數(shù)：334次
采收藥材既要考慮到因品種、產(chǎn)地不同而致采收時日不同，也要考慮到即使同一品種因治療目的的不同而可能有不同的采收期限。隨著現(xiàn)代科學(xué)研究的發(fā)展，很多藥用植物都有了新的適應(yīng)癥，這與藥材內(nèi)有多種有效成分的存在是分不開的，各個成分可能單獨(dú)或協(xié)同作用于治療目的。如鐵皮石斛，含有生物堿、多糖和氨基酸等有效成分，對石斛不同生長期的產(chǎn)量、有效成分含量及功效進(jìn)行綜合分析。鐵皮石斛以清音明目為治療目的，應(yīng)在第4年采收，以增強(qiáng)免疫為治療目的，宜在第1或第3年采收。
采收期不僅對藥材的外觀特征有影響，還直接決定了其內(nèi)在品質(zhì)和藥用價值。近年來，有中藥研究機(jī)構(gòu)使用質(zhì)譜成像技術(shù)開展藥材不同生長期研究，島津技術(shù)團(tuán)隊(duì)結(jié)合與藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)合作案例及文獻(xiàn)開展本次案例分享。
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前沿合作 | 島津成像質(zhì)譜技術(shù)助力連翹不同采收期指標(biāo)成分變化規(guī)律研究【1】
島津中國創(chuàng)新中心與河北省藥檢院國家藥監(jiān)局中藥材質(zhì)量監(jiān)測評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)合作，采用成像質(zhì)譜顯微鏡（iMScope QT）研究了連翹中的主要活性成分的分布，并探討了成像質(zhì)譜顯微鏡用于連翹質(zhì)量控制的新方法，合作成果在2024年7月發(fā)表在《Journal of Mass Spectrometry》雜志上。
連翹（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl）是木樨科連翹屬灌木，廣泛分布于山西、河南、陜西等地，以野生資源為主，具有顯著的抗炎、抗菌、抗氧化和抗病毒活性。本研究子項(xiàng)目之一是采用iMScope QT測定了不同采收期連翹中化學(xué)成分的分布，從而了解整個生長期內(nèi)活性成分變化規(guī)律，提出了新的研究思路。
通過質(zhì)譜成像分析，在連翹果實(shí)中可以檢測到多達(dá)53種藥物活性成分，證明基于大氣壓MALDI的質(zhì)譜成像技術(shù)是一種評價連翹品質(zhì)的有效方法。連翹果實(shí)包含三個主要部分（果皮（pericarp）、頂部（top）和果核（kernel））。圖1顯示了15種典型活性成分在青翹全果中的分布。其中，以[M+K]+的形式檢測到9個，以[M+Na]+的形式檢測到3個，以[M+H]+的形式檢測到3個。連翹中鉀含量較高，可能高含量的鉀促進(jìn)了MALDI離子源中[M+K]+的生成。
圖1 藥物活性成分在連翹果實(shí)中的分布(曹川，2022)
本研究檢測到的26種活性成分根據(jù)活性成分變化規(guī)律和含量水平可以分為四組，分別命名為G1、G2、G3和G4。圖2展示了G1和G2組活性成分隨采收時間的變化規(guī)律，連翹酯苷A在后期含量顯著下降，驗(yàn)證了藥典結(jié)論。
G1組包括連翹梾木苷、連翹脂苷、金絲桃苷、槲皮素、化合物A、二氫楊梅素和阿魏酸；
G2組包括連翹苷、羅漢松脂苷、毛柳苷和連翹酯苷A；
G3組包括Onjixanthone I、羥基熊果酸、白樺脂酸、木犀草素7-O-(6''-丙二酸單酰葡萄糖苷)、鳶尾苷、漢黃芩苷和連翹梾木苷A；
G4組化合物包括蘆丁、連翹環(huán)己醇苷A、連翹環(huán)己醇苷B、山茱萸苷、五?；ㄜ账帷⑿芄?、橙皮苷和木通苯乙醇苷 A。
圖2 G1和G2組成分的相對含量與采收時間的關(guān)系（采樣日期含“L”的樣品為老翹，曹川2019）
活性成分的含量變化與其生物合成和降解密切相關(guān)。圖3總結(jié)了連翹果實(shí)中典型成分的生物合成和降解途徑。作為生物合成的最終產(chǎn)物，連翹酯苷A、連翹苷和毛柳苷在青翹中的含量高于老翹中的水平是合理的（圖2）。一旦生物合成停止（或者當(dāng)果實(shí)成熟時），糖苷類化合物會發(fā)生脫糖基化、脫水和水解反應(yīng)，這些反應(yīng)有助于老翹中金絲桃苷和槲皮素的積累（圖3（a））以及連翹脂素和阿魏酸（圖3（d））的增加。連翹梾木苷A（suspensaside A）和木通苯乙醇苷 A（calceolarioside A）也含有糖苷鍵，但它們的含量變化不大（G3和G4組）。這可能是因?yàn)檫B翹梾木苷（suspensaside）的降解能補(bǔ)償它們的損失（圖3（c））。山茱萸苷（cornoside）、連翹環(huán)己醇苷 A（rengyoside A）和連翹環(huán)己醇苷 B（rengyoside B）的含量變化也不顯著（G4組）。山茱萸苷的氧化可以補(bǔ)償毛柳苷（salidroside）的損失。對于連翹環(huán)己醇苷 A和連翹環(huán)己醇苷 B，也許化合物的穩(wěn)定性足夠高，因此從青翹到老翹它們的含量變化不顯著（圖3（b））。
圖3 五種成分在連翹果實(shí)中的生物合成及降解途徑
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利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像技術(shù)可視化枸杞果實(shí)不同發(fā)育階段內(nèi)源分子的空間分布【2】
枸杞子作為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有滋肝補(bǔ)腎、益精明目的功效。目前，枸杞子作為中藥材和功能食品在全世界廣泛使用，也是西北各省的重要經(jīng)濟(jì)作物。在枸杞果實(shí)成熟過程中，它產(chǎn)生的內(nèi)源性分子構(gòu)成了復(fù)雜的空間代謝網(wǎng)絡(luò)，這些內(nèi)源性代謝物在植物的抗病防御反應(yīng)及信號傳遞中發(fā)揮著重要作用，更為重要的是它們也是天然藥物的重要來源。因此，揭示藥用植物不同生長階段中次生代謝產(chǎn)物的組織分布特征及其累積規(guī)律,對其次生代謝產(chǎn)物合成研究以及調(diào)控、優(yōu)化栽培生產(chǎn)技術(shù)、培育和保護(hù)優(yōu)良種質(zhì)資源等方面都有重要意義。
在本研究中，使用質(zhì)譜成像技術(shù)建立了一種簡單、可靠的方法直接可視化枸杞果實(shí)組織中內(nèi)源性分子的空間分布特征，為進(jìn)一步了解枸杞果實(shí)生長過程中內(nèi)源性分子的生理作用提供了一種空間可視化方式，同時突出了質(zhì)譜成像作為一種可行性工具在藥用植物領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。本研究實(shí)驗(yàn)思路見圖1。
圖1 利用質(zhì)譜成像技術(shù)可視化枸杞果實(shí)中內(nèi)源性分子分布
采集花后15d、28d、31d的枸杞果實(shí)作為研究樣品，分別對應(yīng)S1期（綠色）、S2期（黃綠色）和S3期（紅色）。采用iMScope TRIO 成像質(zhì)譜顯微鏡對三個不同生長期的枸杞果實(shí)進(jìn)行了糖（己糖、蔗糖）、檸檬酸、生物堿（甜菜堿、膽堿）及多酚類內(nèi)源性分子的空間分布分析。如圖2所示，膽堿、甜菜堿和檸檬酸在所有生長期均勻分布在整個果實(shí)中。己糖分布于內(nèi)果皮和果肉組織中，而蔗糖位于種子中。
圖2 (a) S1 ~ S3時期枸杞果實(shí)的光學(xué)圖像。(b-f)正離子模式：m/z 104.11（膽堿）、156.04（甜菜堿）、230.09（檸檬酸）、219.03（己糖）和381.08（蔗糖）的質(zhì)譜成像圖
隨著果實(shí)發(fā)育，檸檬酸的信號強(qiáng)度在減弱，而膽堿、甜菜堿、己糖和蔗糖的信號強(qiáng)度在增加。此外，如圖3所示，隨著果實(shí)成熟，三種酚酸和四種黃酮類化合物在外果皮中積累。有報(bào)道稱，酚類化合物在植物抵御病原菌侵襲和紫外線照射方面發(fā)揮著重要的保護(hù)作用。這表明它們可能在枸杞果實(shí)生長過程中發(fā)揮了某種非生物和生物脅迫的保護(hù)作用，具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
圖3 (a) S1 ~ S3時期枸杞果實(shí)的光學(xué)圖像。(b-h)負(fù)離子模式：m/z 163.04（對香豆酸）、179.03（咖啡酸）、285.04（山奈酚）、301.03（槲皮素）、315.05（異鼠李素）、353.09（綠原酸）和463.09（異槲皮素）的質(zhì)譜成像圖
本研究結(jié)果有助于更好的了解枸杞子不同成熟期生物活性物質(zhì)的分布，為枸杞子成分識別、質(zhì)量評價、高值化利用等提供參考。
以上內(nèi)容是對研究文獻(xiàn)的概述，如需了解詳細(xì)內(nèi)容，可根據(jù)以下文獻(xiàn)目錄搜尋全文。
參考文獻(xiàn)
【1】Liu Y ,Wang C ,Chen Z , et al.Distribution of active ingredients and quality control of Forsythia suspensa with AP-MALDI mass spectrometry imaging.[J].Journal of mass spectrometry : JMS,2024,59(8):e5073.
【2】]Hua W Z ,Da Y Z ,Ping Y S .Visualizing the spatial distribution of endogenous molecules in wolfberry fruit at different development stages by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging[J].Talanta,2021,234122687-.
iMScope QT
島津成像質(zhì)譜顯微鏡iMSCope QT
iMScope成像質(zhì)譜顯微鏡是用于質(zhì)譜成像分析的整合型儀器，前端搭載高分辨光學(xué)顯微鏡及大氣壓基質(zhì)輔助激光解吸電離源（Atmospheric Pressure -MALDI，AP-MALDI），后端配置四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（Q-TOF）iMScope既可以對樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)上的細(xì)微觀察，又可以對特定的分子進(jìn)行鑒定以及高分辨的可視化分布分析。
質(zhì)譜成像原理示意圖
島津成像質(zhì)譜顯微鏡iMSCope QT 的特點(diǎn)
? 5 μｍ高空間分辨率
? 顯微鏡觀察和質(zhì)譜成像分析的融合
? 高速分析，激光器掃描頻率高至 20 kHz，最快成像速度50 像素/秒
? 兼容LC-QTOF系統(tǒng)，一臺儀器同時完成定性、定量及定位分析
? 常壓MALDI，可以分析具有一定揮發(fā)性的樣品，如多環(huán)芳烴和姜黃素
? 配備完整的前處理基質(zhì)涂敷設(shè)備（基質(zhì)升華儀iMLayer 與全自動噴霧儀iMLayer AERO）
? 簡便、專業(yè)的成像分析軟件IMAGEREVEAL MS
撰稿人：豐偉剛
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