新方法丨血友病“救命藥”——人凝血因子VIII中聚合物雜質(zhì)分析
發(fā)布時(shí)間:2025-03-17 閱讀次數(shù)：358次
導(dǎo)讀
血友病是一種遺傳性疾病，患者可能因?yàn)檩p微碰撞，就會(huì)流血不止，嚴(yán)重時(shí)將危及生命，其病因是缺少凝血因子。人凝血因子VIII就是一種重要的凝血因子，是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌入血的蛋白質(zhì)，缺乏將導(dǎo)致甲型血友病。目前血友病的治療以替代療法為主，就是常說的“缺啥補(bǔ)啥”，即向患者體內(nèi)輸注缺少的凝血因子來幫助止血，可以說凝血因子是血友病患者的“救命藥”。
人凝血因子VIII產(chǎn)品可由人血漿中分離提取或經(jīng)基因重組技術(shù)生產(chǎn)。我國臨床上主要使用的是人血漿來源產(chǎn)品，其成分較為復(fù)雜，除人凝血因子Ⅷ外，還可能含有多種血漿蛋白、肝素鈉、聚乙二醇 3350、聚山梨酯80、氨基酸、磷酸三丁酯等諸多成分。其中聚乙二醇和聚山梨酯80為生產(chǎn)中用到的試劑，前者用于分離純化，后者用于病毒滅活，需要監(jiān)控其在終產(chǎn)品中的殘留量。
人凝血因子VIII中聚合物雜質(zhì)是怎么產(chǎn)生的呢？
人凝血因子VIII中主要有兩種聚合物雜質(zhì)，分別是聚乙二醇3350（又名PEG3350）和聚山梨酯80（又名吐溫80）。
聚乙二醇3350是一種親水性聚合物，廣泛用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離純化，也是人凝血因子VIII分離制備過程中的常用試劑。相關(guān)研究表明，聚乙二醇可能是一種半抗原，應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制。
聚山梨酯80是一種非離子型表面活性劑及乳化劑，廣泛用作藥物輔料。人血漿來源的人凝血因子VIII產(chǎn)品具有潛在病毒風(fēng)險(xiǎn)，為保證其安全性，需要進(jìn)行病毒滅活。常用的病毒滅活工藝為有機(jī)溶劑/去污劑(S/D)處理法，即采用有機(jī)溶劑磷酸三丁酯和表面活性劑聚山梨酯80結(jié)合進(jìn)行病毒滅活。為保證產(chǎn)品安全性和有效性，應(yīng)在滅活后去除滅活試劑，并對(duì)其殘留量進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控?！吨袊幍洌?020年版）》對(duì)聚山梨酯80的殘留量要求是不高于100 μg/mL。
人凝血因子VIII中聚合物雜質(zhì)怎么測(cè)?
《中國藥典（2020年版）》第三部人凝血因子Ⅷ檢定項(xiàng)下，聚乙二醇和聚山梨酯80殘留量的測(cè)定，分別依照通則3202和通則3203，采用紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行測(cè)定。該方法選擇性低，容易受到共存物干擾。
另一種聚合物分析常用方法是尺寸排阻色譜法，由于聚山梨酯80、聚乙二醇3350、肝素鈉等聚合物分子量分布存在交疊，難以分離，影響定量準(zhǔn)確性。
因此，開發(fā)一種選擇性好，準(zhǔn)確度高的分析方法進(jìn)行聚合物雜質(zhì)的分析，很有必要。
- 島津解決方案 -
我們開發(fā)了一種液相色譜儀結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD-LT Ⅲ檢測(cè)人凝血因子Ⅷ中聚合物殘留的分析新方法。聚乙二醇3350和聚山梨酯80均無紫外吸收，使用ELSD-LT Ⅲ既可實(shí)現(xiàn)高靈敏度的定量測(cè)定，又可通過梯度洗脫改善分離，有效避免人凝血因子Ⅷ中復(fù)雜共存物的干擾。
。分析儀器
島津Nexera LC-40液相色譜儀+蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD-LT Ⅲ
。方法學(xué)結(jié)果
使用外標(biāo)法繪制校準(zhǔn)曲線，聚乙二醇3350和聚山梨酯80相關(guān)系數(shù)大于0.998，回讀值準(zhǔn)確度在90.9~109.3%之間，線性良好；校準(zhǔn)曲線低濃度六次連續(xù)進(jìn)樣的峰面積RSD不大于3%，精密度良好；校準(zhǔn)曲線低濃度下的加標(biāo)回收率在93.2~103.6%之間，準(zhǔn)確可靠。
圖1. 聚乙二醇3350色譜圖（左，50 mg/L）和校準(zhǔn)曲線（右）
圖2. 聚山梨酯80色譜圖（左，10 mg/L）和校準(zhǔn)曲線（右）
表1. 方法學(xué)結(jié)果
。實(shí)際樣品分析
人凝血因子VIII復(fù)溶液高速離心后上機(jī)分析，樣品中未檢出聚乙二醇3350，檢出聚山梨酯80，含量為38.9 mg/L。
圖3 人凝血因子Ⅷ樣品色譜圖
結(jié)語
血友病患者因?yàn)橄忍旎蛲蛔儗?dǎo)致體內(nèi)凝血因子不足，通常需要終身注射補(bǔ)充凝血因子?？紤]到臨床長期用藥的特點(diǎn)，凝血因子類產(chǎn)品的安全性尤為重要。聚乙二醇3350和聚山梨酯80是人凝血因子Ⅷ生產(chǎn)中的重要試劑，但都有潛在不安全性的特點(diǎn)。因此，準(zhǔn)確測(cè)定人凝血因子Ⅷ產(chǎn)品中聚合物雜質(zhì)殘留量，保證其在安全限度內(nèi)，十分必要。液相色譜儀結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測(cè)器ELSD-LT Ⅲ進(jìn)行聚合物雜質(zhì)殘留量測(cè)定，可有效避免人凝血因子Ⅷ產(chǎn)品中復(fù)雜共存物干擾，靈敏、準(zhǔn)確、前處理簡單，讓血友病“救命藥”更安全，患者用藥更安心。
撰稿人：唐雪
注：本方案及涉及產(chǎn)品僅限用于科學(xué)研究，不可用于醫(yī)療用途及臨床診斷。