2025年版《中國(guó)藥典》9120氨基酸分析指導(dǎo)原則綜合方案及特色分析技術(shù)應(yīng)用
發(fā)布時(shí)間:2025-06-11 閱讀次數(shù)：115次
導(dǎo)語(yǔ)
復(fù)方氨基酸制劑、多肽類藥物、蛋白質(zhì)類藥物、含氨基酸/多肽/蛋白質(zhì)的組織提取物類藥物和中藥等藥品中氨基酸的組成或含量的檢測(cè)，需通過(guò)氨基酸分析方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。
氨基酸分析系指采用適宜的方法測(cè)定蛋白質(zhì)、多肽或其他藥物制劑中氨基酸組成和(或)含量。蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸分析,需要將樣品先水解成游離的氨基酸才能進(jìn)行分析,游離氨基酸通常需要衍生化后才能測(cè)定。
歐洲藥典、英國(guó)藥典、美國(guó)藥典及日本藥典中均收載了氨基酸分析指導(dǎo)原則，《中國(guó)藥典》2025年版首次收載9120氨基酸分析指導(dǎo)原則?！吨袊?guó)藥典》收載的復(fù)方氨基酸注射液、多肽類藥物及中藥品種，均需采用氨基酸分析方法測(cè)定藥品中氨基酸含量或氨基酸組成。該指導(dǎo)原則指導(dǎo)藥典標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行過(guò)程中如何選擇適宜的氨基酸分析方法，主要內(nèi)容包括基本要求、蛋白質(zhì)和多肽樣品的水解、氨基酸測(cè)定法和數(shù)據(jù)處理。
藥典收載分析方法及特點(diǎn)
島津綜合解決方案
綜合解決方案覆蓋指導(dǎo)原則分析方法外，針對(duì)藥品研發(fā)和質(zhì)量研究，可提供氨基酸構(gòu)型組成分析，專業(yè)的蛋白質(zhì)測(cè)序儀將對(duì)反應(yīng)單元和快捷液相色譜分析單元提供控制功能，便于進(jìn)行序列分析。
典型方案及應(yīng)用案例
1自動(dòng)柱前OPA-FMOC分析方案
方案特色：參考藥典指導(dǎo)原則，使用島津氨基酸全自動(dòng)柱前衍生方法包（AJS-01），適配多型號(hào)島津液相，自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)衍生，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。
島津氨基酸全自動(dòng)柱前衍生方法包（AJS-01）含氨基酸專用分析柱、氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、衍生試劑、緩沖液和內(nèi)標(biāo)溶液，支持島津全系列液相色譜儀，即裝即用，利用自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)衍生，高效便捷。
圖1. 22種氨基酸混標(biāo)色譜圖（含兩種內(nèi)標(biāo)，上：338 nm,下：262 nm）
? 司美格魯肽氨基酸組成和氨基酸比值分析結(jié)果
司美格魯肽是一款用于糖尿病治療和體重管理等病癥的明星多肽藥物，主鏈由17種31個(gè)氨基酸組成。參考指導(dǎo)原則對(duì)司美格魯肽樣品分別進(jìn)行鹽酸水解和氫氧化鈉水解處理，由于鹽酸水解多肽會(huì)破壞色氨酸結(jié)構(gòu)，所以利用氫氧化鈉水解法分析司美格魯肽中的色氨酸。
司美格魯肽樣品中檢出17種氨基酸，與理論氨基酸組成一致。氨基酸比值與理論值的相對(duì)誤差在0.10~8.86%之間，結(jié)果準(zhǔn)確。17種氨基酸的回收率在93.8~110.8%之間，方法可靠。
司美格魯肽樣品色譜圖
2自動(dòng)柱后茚三酮衍生法分析方案
方案特色：參考藥典指導(dǎo)原則，使用島津氨基酸分析儀 LC-16AAA，試劑、耗材、專用軟件配套齊全，可全自動(dòng)、高效、準(zhǔn)確地測(cè)定樣品。
島津氨基酸分析儀 LC-16AAA，結(jié)合配套流動(dòng)相、標(biāo)準(zhǔn)品和衍生試劑，以及簡(jiǎn)單易操作的專用軟件，軟件內(nèi)置實(shí)驗(yàn)方法，可全自動(dòng)進(jìn)行樣品測(cè)試。
根據(jù)“9120 氨基酸分析指導(dǎo)原則”氨基酸測(cè)定法--方法六中規(guī)定，一般選擇水解處理中穩(wěn)定的氨基酸用于多肽的定量;在本例中，有6種水解穩(wěn)定的氨基酸被選做多肽定量，同時(shí)指導(dǎo)原則也指出多肽樣品的氨基酸比值由各氨基酸的濃度除以多肽的平均濃度獲得，該樣品各氨基酸濃度及比值分析結(jié)果如上表所示。
3D/L 氨基酸構(gòu)型分析 LMSMS縮宮素分析案例
L型氨基酸屬于天然存在的氨基酸構(gòu)型，可合成蛋白質(zhì)，作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在人體內(nèi)大量存在，而 D型氨基酸體內(nèi)含量極低，多為人工合成，但它對(duì)于發(fā)酵食品成分分析、生理功能分析、顱神經(jīng)系統(tǒng)分析和生物標(biāo)志物檢索等各個(gè)領(lǐng)域中起著至關(guān)重要的作用，甚至關(guān)乎人類的健康和美麗。
氨基酸(除了甘氨酸)都有一個(gè)手性碳原子相鄰的羧基。氨基酸手性中心的立體異構(gòu)會(huì)形成一對(duì)以彼此為鏡像的立體異構(gòu)。結(jié)構(gòu)彼此十分相似，就好像的左手、右手。這些鏡像被稱為對(duì)映異構(gòu)體。
D/L兩種氨基酸成分分析經(jīng)常受到各種各樣的肽或氨基化合物的背景干擾，分析難度大，并且傳統(tǒng)的氨基酸異構(gòu)體分析必需進(jìn)行氨基酸的衍生化處理，分析時(shí)間長(zhǎng)(通常分析時(shí)間超過(guò) 10 小時(shí))。因此急需建立靈敏、高效的分析方法。
面對(duì)氨基酸異構(gòu)體的分析難點(diǎn)，島津推出 LC/MS/MS D/L氨基酸分析方法包。本方法采用手性色譜柱實(shí)現(xiàn)在 10 分鐘之內(nèi)完成高靈敏度的氨基酸異構(gòu)體的分離和檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合LCMS-8045/8050/8060 的高靈敏度分析能力可省去氨基酸衍生化的實(shí)驗(yàn)流程。
左：42 種 D/L 型氨基酸 MRM 色譜圖總圖(分析方法包推薦色譜柱一)
右：42 種 D/L 型氨基酸 MRM 色譜圖總圖(分析方法包推薦色譜柱二)
對(duì)縮宮素藥物進(jìn)行酸水解和檢測(cè)，由分析結(jié)果得出，在該多肽水解樣品中共檢測(cè)到 12 種氨基酸，其中 D型氨基酸5 種、L型氨基酸5 種。Cys-Cys 二硫鍵未打開(kāi)，Tyr 部分水解被破壞，Gln 水解轉(zhuǎn)化為 Glu，Asn 水解轉(zhuǎn)化為 Asp，因此 Cys、Gln、Asn 三種氨基酸未檢測(cè)到，DL-Pro 是一種仲胺，不能用當(dāng)前分析條件分離，Gly無(wú)手性。
水解樣品總 D/L型氨基酸色譜圖
4蛋白測(cè)序儀測(cè)定多黏菌素B的氨基酸序列
PMB（多黏菌素B）為發(fā)酵的多肽類抗生素，組分種類較多，其中占比較高的四種主要組分包括B1、lle-B1、B2、B3，組成氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、二氨基丁酸，除苯丙氨酸的構(gòu)型為D型外，其余氨基酸均為L(zhǎng)型。目前對(duì)多黏菌素B結(jié)構(gòu)的研究主要為氨基酸組成成分、氨基酸構(gòu)型分析等，鮮有氨基酸序列的研究報(bào)道。
氨基酸序列是其能否正確發(fā)揮生物活性的重要基礎(chǔ)，有必要對(duì)多黏菌素B的氨基酸序列進(jìn)行確證。對(duì)氨基酸構(gòu)型的分析方法包括水解后的手性衍生-色譜/質(zhì)譜法、直接采用手性色譜分析，然而這種方法測(cè)定的是氨基酸混合物，無(wú)法確定每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸及其構(gòu)型。
Edman降解法可以彌補(bǔ)以上缺陷，從N端開(kāi)始測(cè)定每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸，但需裸露出N端氨基酸的a-氨基。本研究以B2組分為例，對(duì)其進(jìn)行分離純化和酶解后，獲得去除N-?；炬溂?位二氨基丁酸的肽鏈解除了N端封閉，通過(guò)PPSQ-53A測(cè)定其氨基酸順序。該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏可靠，可作為多肽類抗生素氨基酸序列分析時(shí)的參考。
PTH-氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)測(cè)試圖譜
DABA 標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試圖譜 經(jīng)酶解處理的 PMB2 氨基酸序列分析色譜圖
經(jīng)酶解處理的 PMB2 氨基酸序列分析色譜圖
由圖可知，樣品氨基酸序列為 Thr-DABA-X-DABA-Phe-Leu-DABA-DABA-Thr(x代表無(wú)信號(hào)檢出)，與理論順序一致。第三位氨基酸在原構(gòu)型中與相鄰氨基酸為環(huán)狀連接當(dāng) Edman 反應(yīng)發(fā)生時(shí)，一端被切開(kāi)，另一端仍與相鄰氨基酸相連，因此在檢測(cè)中理論無(wú)氨基酸信號(hào)產(chǎn)生。
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