如何用好島津PDA檢測(cè)器（上篇）
發(fā)布時(shí)間:2020-08-05 閱讀次數(shù)：5627次
導(dǎo) 語(yǔ)
相對(duì)于HPLC中的紫外檢測(cè)器的簡(jiǎn)單操作來(lái)說(shuō)，PDA檢測(cè)器的使用和應(yīng)用可以說(shuō)是難上了級(jí)別，光源選擇、狹縫、帶寬、參比波長(zhǎng)等如何選擇甚是燒腦。本期我們以 SPD-M20A 檢測(cè)器為例，聊一聊 PDA 檢測(cè)器的使用設(shè)置和譜圖解析方面的注意事項(xiàng)。
首先提出三個(gè)問(wèn)題，針對(duì)這三個(gè)問(wèn)題的展開介紹，使大家對(duì)PDA 檢測(cè)器的有更深刻的認(rèn)識(shí)：
? 為什么會(huì)選擇使用PDA檢測(cè)器，優(yōu)勢(shì)何在？
? 如何使用好PDA檢測(cè)器。
? 如何利用PDA檢測(cè)器的功能為我們提供更多的信息，更大的幫助？
NO.1 過(guò)人之處 — 特殊的光路系統(tǒng)
二極管陣列檢測(cè)器(PDA)是HPLC 應(yīng)用中比較多的一款通用型檢測(cè)器，其光路系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)由光源、半透半反鏡、M1 鏡、濾光裝置、流通池、M2 鏡、狹縫、光柵、光電二極管陣列組成。
針對(duì)于紫外檢測(cè)器來(lái)說(shuō)：
1、可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)多波段檢測(cè)；
2、可以通過(guò)光譜圖鑒別物質(zhì)；
3、可以通過(guò)光譜圖進(jìn)行色譜峰的純度。
NO.2如何找到實(shí)驗(yàn)合適的設(shè)置方法
我們使用中發(fā)現(xiàn)PDA參數(shù)設(shè)置是很復(fù)雜的，十分燒腦。針對(duì)PDA參數(shù)設(shè)置，提出以下建議：
設(shè)置方法前，我們面臨的各項(xiàng)參數(shù)，首先列出各參數(shù)的設(shè)置范圍及影響。
通過(guò)對(duì)PDA參數(shù)的闡述，針對(duì)方法中參數(shù)設(shè)置我們提出設(shè)置建議：
燈的選擇
使用D2燈和W燈作為光源，提供190-800nm波長(zhǎng)范圍的吸收光譜。
D2 燈使用波長(zhǎng)范圍：190-600nm
W 燈使用波長(zhǎng)范圍：371-800nm
D2+W 同時(shí)使用范圍：190-800nm
對(duì)于僅限于紫外線區(qū)域的測(cè)量，只應(yīng)使用D2 燈，根據(jù)實(shí)際的流動(dòng)相比例并設(shè)置合理波長(zhǎng)范圍。
例如：純甲醇為流動(dòng)相，我們?cè)O(shè)置的波長(zhǎng)范圍盡量避免流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)。
②光電二極管曝光時(shí)間
光源在光電二極管元件上駐留的時(shí)間，這里以單反相機(jī)舉例，在光線充裕的拍照需要將底片的曝光時(shí)間縮短，否則曝光過(guò)度，底片感光飽和，照片一邊白光（即 PDA 靈敏度，分辨率變差）；在 夜晚或光線不足的拍照需要將底片的曝光時(shí)間延長(zhǎng)，否則曝光不足，底片感光不足，照片模糊不清，噪點(diǎn)增多（即 PDA 噪音變大））；PDA 可以自動(dòng)調(diào)整器曝光時(shí)間，也就是在現(xiàn)有光強(qiáng)度的情況下，將光源在光電二極管元件上駐留的時(shí)間加以優(yōu)化，在保證 PDA 的分辨率，靈敏度同時(shí)降低基線噪音。
在更換氘燈或者更換流通池是要重新調(diào)整曝光時(shí)間的，儀器時(shí)間長(zhǎng)了光路系統(tǒng)老化也需要重新調(diào)整曝光時(shí)間。
③采樣時(shí)間
測(cè)量數(shù)據(jù)按此采樣時(shí)間循環(huán)輸出。
作為指導(dǎo)性原則，分析物峰內(nèi)大約30個(gè)測(cè)量點(diǎn)以上即可滿足數(shù)量測(cè)定要求。
示例： 如果峰寬（從峰開始到峰結(jié)束的時(shí)間）是 30 秒，設(shè)定采樣時(shí)間為 1 秒，則峰內(nèi)有 30 個(gè)測(cè)量點(diǎn)。
如果采樣時(shí)間減少，則每單位出峰時(shí)間的測(cè)量點(diǎn)數(shù)量增加，也就改進(jìn)了數(shù)量測(cè)定結(jié)果，保證了峰形的真實(shí)性。但是，數(shù)據(jù)文件大小也相應(yīng)增加。
當(dāng)執(zhí)行快速洗脫的數(shù)量測(cè)定時(shí)，出現(xiàn)尖峰，采樣時(shí)間應(yīng)設(shè)定較小的采樣時(shí)間值。
采樣時(shí)間和曝光時(shí)間的關(guān)系：1 個(gè)采樣時(shí)間輸出的數(shù)據(jù)是 1 個(gè)采樣時(shí)間內(nèi)曝光時(shí)間采集數(shù)據(jù)的平均值。
示例： 曝光時(shí)間 20ms，采樣時(shí)間 2000ms，每 2000ms 平均輸出 2000 / 20 = 100 點(diǎn)，這 100 點(diǎn)的平均值就是采樣時(shí)間輸出值。
采樣時(shí)間的倒數(shù)是采樣頻率。
④光譜帶寬
譜帶寬與 PDA 檢測(cè)器在檢測(cè)波長(zhǎng)處的吸光度響應(yīng)息息相關(guān)，如檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為 250 nm，光 譜帶寬設(shè)置為 20 nm，檢測(cè)器吸光度取值處于 240-260 nm 范圍內(nèi)。光譜帶寬設(shè)置的大小影響信噪 比、色譜峰高度、以及色譜峰表觀分離度。
如上圖?，測(cè)量時(shí)會(huì)把246-254nm波長(zhǎng)范圍的吸光度取平均值，作為輸出結(jié)果：帶寬越大，噪音越低，但光譜分辨率也越低，通常設(shè)定為4。
光譜帶寬設(shè)置越大，實(shí)際檢測(cè)波長(zhǎng)范圍涉及的光電二極管的個(gè)數(shù)也就越多(如帶寬設(shè)置 20 nm，光電二極管分辨率 1 nm，涉及的光電二極管個(gè)數(shù)為 20 個(gè))，實(shí)際檢測(cè)到的吸收度平均值以及基線噪 音也隨之降低，但基線噪音降低效果更加顯著。
隨光譜帶寬的增加，涉及的光電二極管數(shù)目亦會(huì)隨之增加，檢測(cè)器實(shí)際檢測(cè)波長(zhǎng)范圍吸收度響應(yīng)平均化程度也會(huì)增加，導(dǎo)致檢測(cè)器的光譜分辨率(區(qū)別與光電二極管分辨率)降低，對(duì)依靠吸收光譜對(duì)化合物進(jìn)行初步鑒別帶來(lái)困難。
建議設(shè)置帶寬為4nm。
⑤狹縫寬度
比較窄的狹縫寬度，有利于提高PDA光電二極管的分辨率，對(duì)于依靠比對(duì)紫外吸收光譜鑒別化合物有利；比較寬的狹縫寬度，則允許更多的光透過(guò)狹縫經(jīng)由光柵發(fā)生色散而被光電二極管檢測(cè)到，其結(jié)果是檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度增加，基線噪音相對(duì)減小，檢測(cè)器的靈敏度增加，但伴隨PDA 光電二極管的分辨率降低。
強(qiáng)調(diào)分辨率的實(shí)驗(yàn)：應(yīng)該選擇1.2nm狹縫。
強(qiáng)調(diào)靈敏度的實(shí)驗(yàn)：應(yīng)該選擇8nm狹縫。
⑥響應(yīng)時(shí)間
響應(yīng)時(shí)間表述的是光電二極管對(duì)于流通池內(nèi)吸收度的突然變化的響應(yīng)速度。響應(yīng)時(shí)間設(shè)置小的時(shí)候，描繪出的色譜峰越能反映真實(shí)情況，色譜峰高度以及基線噪音同時(shí)提高 (基線噪音更加顯著)。響應(yīng)時(shí)間設(shè)置大的時(shí)候，色譜峰高度以及基線噪音同時(shí)減少 (基線噪音更加顯著)。
⑦參比波長(zhǎng)
設(shè)置合適的參比波長(zhǎng)可有效補(bǔ)償流動(dòng)相吸光度變化的影響，可以有效減小基線波動(dòng)以及噪音水平，提高信噪比。特別是在使用HPLC梯度洗脫模式的時(shí)候，流動(dòng)相隨著梯度的不斷變化，其吸光度亦不斷改變，造成背景噪音過(guò)大。
參比波長(zhǎng)設(shè)置越靠近檢測(cè)波長(zhǎng)，基線噪音水平越低，但同時(shí)會(huì)損失一定峰高。一般地，參比波長(zhǎng)要設(shè)置為靠近檢測(cè)波長(zhǎng)但對(duì)檢測(cè)組分沒(méi)有吸收的波長(zhǎng)。
設(shè)置范圍建議：實(shí)際檢測(cè)波長(zhǎng)+100nm且避免樣品在參比波長(zhǎng)處有較大吸收。
注意：
? 建議使用參比波長(zhǎng)在單獨(dú)D2燈為光源情況下進(jìn)行。如果同開啟D2+W燈作為光源時(shí)，可能導(dǎo)致可見(jiàn)光波長(zhǎng)噪音上升。
? 避免樣品在參比波長(zhǎng)處有較大吸收，影響峰高響應(yīng)值。
綜上所述，我們要根據(jù)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整PDA參數(shù)設(shè)置，才能達(dá)到最佳的分析結(jié)果及解析結(jié)果。下期我們具體講解，關(guān)于譜圖解析和純度計(jì)算方面的內(nèi)容，感興趣的小伙伴繼續(xù)關(guān)注哦！
液相工程師梁帥