使用全自動液體萃取平臺ATLAS-LEXT從生物試樣中提取濫用藥物
發(fā)布時間:2021-01-19 閱讀次數(shù)：1207次
提升生物樣品中的毒物、毒品分析預處理流程的自動化程度有助于簡化工作流程，降低操作者感染風險和操作失誤發(fā)生的可能。樣品自動化預處理也可提高檢測數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和定量分析的準確性。與傳統(tǒng)預處理方法相比：
① 全自動液體萃取平臺ATLAS-LEXT配備自動化的移液、振蕩和離心操作單元可提高樣品預處理處理精度。
② 全自動液體萃取平臺ATLAS-LEXT可實現(xiàn)多工作流程并行處理功能并以此提高樣品預處理的樣品制備通量。
本應(yīng)用介紹了學會所發(fā)表的以生物試樣（血液、尿液、毛發(fā)）中的濫用藥物和代謝物為目標物萃取物、利用ATLAS-LEXT進行樣品預處理程序的開發(fā)及方法學評價相關(guān)應(yīng)用信息1）。此外，本文還介紹了ALAS-LEXT的樣品預處理流程，通過萃取溶劑的優(yōu)化制備適用于液相色譜質(zhì)譜和氣相色譜質(zhì)譜適用的待測樣品萃取液。
實驗方法
? 試劑
甲基苯丙胺（methamphetamine）、弗拉卡α-PVP及其代謝物（1-OH-α-PVP）、氯胺酮（ketamine）嗎啡（morphine）可卡因 （cocaine）、苯甲酰愛崗寧（benzoylecgonine）以及四氫大麻酸（THC-COOH）的全血、尿液（添加濃度為25 ng/mL~5 μg/mL）以及毛發(fā)（通過研磨粉碎提取方法制得懸浮液，添加濃度0.5 ng/mg）
? 預處理
全血的自動試樣制備:全血試樣開發(fā)了2種制備方法：甲醇沉淀法和液-液萃取法。甲醇沉淀法+ATLAS-LEXT的自動預處理流程見圖1。取試樣（用去離子水將添加上述藥物的全血樣品稀釋2.5倍）500μL，移入試管，加甲醇1000μL，振蕩5秒鐘，2000 ×g下離心280秒，然后移取上清液800 μL。同時重復提取操作2次，合并2次萃取液，加0.3 mol/L鹽酸酸化的乙醇溶液（1:40）100 μL，用氮氣吹干，加10%甲醇水溶液（275μL），混合60秒鐘以重新溶解，2000×g下離心5分鐘，然后移取上清液250μL，注入LC-MS/MS自動進樣器的小瓶。（所需時間:每個試樣約24分鐘。采用并行處理流程可縮短處理時間約33%）
圖1 甲醇沉淀法對濫用藥物的自動提取流程
? 尿液的自動樣品預處理
液-液萃取法+ATLAS-LEXT的自動預處理流程見圖2。取尿液試樣500μL，放入瓶中，加1.0mol/L的碳酸鹽緩沖液80μL，將調(diào)節(jié)pH=9，加氯仿：2-丙醇（3:1）1200μL，振蕩75秒鐘，2000×g下離心90秒鐘。防乳化自動檢測，移取溶劑下層溶液800μL。重復提取操作3次，合并3次萃取液，加0.3mol/L鹽酸酸化乙醇溶液（1:40）70μL，氮氣吹干，加10%甲醇水溶液（275μL），振蕩60秒鐘以重新溶解，2000×g下離心6分鐘，然后吸取上清液250μL，注入LC-MS/MS自動進樣器的小瓶。（所需時間:每個試樣約17分鐘。并行處理可縮短處理時間約30%）
? 毛發(fā)的自動樣品預處理
取毛發(fā)10mg，用50mM乙酸鹽緩沖液（pH5.0）800μL，預先粉碎并制備懸浮液，采用液-液萃取法并通過ATLAS-LEXT進行自動預處理。（參照圖2）（所需時間：每個試樣約23分鐘）
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圖2 液-液萃取法對濫用藥物的自動提取流程
? 回收率的測定
使用配制濃度為50ng/mL的全血添加樣品和尿液樣品、配制濃度為0.5 ng/mg毛發(fā)添加樣品（通過研磨粉碎提取方法制得懸浮液），并通過ATLAS-LEXT進行全自動預處理，制得樣品后，添加內(nèi)標阿普唑侖-d5，分析并計算回收率。
? 定量限及殘留實驗
在0.1~200ng/mL的范圍內(nèi)制作每種待測物的標準曲線。添加樣品連續(xù)處理后測定空白樣品，驗證沒有殘留物。
? LC-MS/MS條件
LC：島津UFLC Prominence、MS：電離：ESI（Positive）、色譜柱: L-column 2 ODS（1.5mm i.d.×150mm，5μm）、流動相：10mM 乙酸銨水溶液及甲醇[5%-（15min）–95%（10min）、柱溫：40℃、流速：0.1mL/min。向上述制備試樣添加阿普唑侖-d5（內(nèi)標）溶液， MRM模式下進行分析。
實驗結(jié)果與考察
? 回收率驗證
各藥物的回收率見表1。采用甲醇沉淀法從全血（用水稀釋2.5倍，500μL）中預處理并計算毒品（添加濃度50ng/mL）萃取回收率，均在62~71%的范圍內(nèi)，RSD小于14%，滿足回收率要求。采用液-液萃取法從500μL尿液中預處理并計算毒品（添加濃度50ng/mL）萃取回收率，除酸性物質(zhì)THCCOOH外，其他藥物的回收率均在62~100%的范圍內(nèi)，RSD小于17%，滿足回收率要求。以濃度0.5ng/mg 毒品成分毛發(fā)添樣品10mg預處理并計算萃取回收率，苯甲酰愛崗寧的回收率為54%，其它藥物的回收率為71~94%，RSD小于9%，重復性、精密度穩(wěn)定。
表1 各種毒品回收率（%）
? 定量限驗證
對于添加到全血中的各藥物，根據(jù)內(nèi)標法繪制的標準曲線結(jié)果見圖3。所有標準曲線在0.1 - 200ng/mL的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。
圖3 從全血中提取藥物并通過LC-MS/MS進行定量分析的標準曲線
? 殘留實驗
連續(xù)處理5個高濃度試樣后，對空白試樣進行預處理，通過LC-MS/MS進行高靈敏度分析，未檢測出藥物峰，確認沒有殘留物。
總結(jié)
ATLAS-LEXT是一款搭載高速離心（2000×g）單元和配有一次性槍頭精密移液單元的自動預處理裝置，島津開發(fā)了生物樣品（血液、尿液、毛發(fā)）中的濫用藥物（毒品）提取程序，并驗證方法學有效性。結(jié)果表明，ATLAS-LEXT可代替?zhèn)鹘y(tǒng)手工操作流程，以自動化的流程實現(xiàn)自動化預樣品操作。
1. 具備乳化監(jiān)測組件，有效防止易與生物樣品發(fā)生乳化的氯仿-2-丙醇（3:1）并通過液-液萃取法萃取生物樣品中的毒品成分，并實現(xiàn)了樣品制備工藝全自動。
2. 可采用血液樣品蛋白質(zhì)甲醇沉淀萃取法，實現(xiàn)了樣品制備工藝全自動。
3. 實現(xiàn)毛發(fā)樣品中痕量藥物的樣品制備工藝全自動。
4. 有效減少樣品間的交叉污染，具備良好的定量分析樣品預處理能力。
ATLAS-LEXTTM的自動預處理流程編輯示例
* 參考文獻：日本法中毒學會第37屆年會演講摘要集P-04